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培養條件的優化及細胞移植實驗方法
點擊次數:1250 更新時間:2016-03-23

    主要試劑   DMEM培養基 (GIBCO/BRL 、高糖)、胎牛血清(fetal calf serum , FCS , Hyclone)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF , R&D公司)、白血病抑制因子(LIF,R&D公司)、培養液A:DMEM液(高糖)+5%胎牛血清+0. mol/Lβ-巰基乙醇+2 mmol/L+00 U/ml+00 U/L 、培養液B:DMEM液(高糖)+5%胎牛血清+0. mol/Lβ-巰基乙醇+2 mmol/L +00 U/ml+00 U/L +000 U/ml hLIF + ng/ml bFGF[30]、(Sigma)及EDTA、MAB-28(小鼠抗人細胞核單克隆抗體,CHEMICHON)、正常山羊血清 (博士德公司)、EnVision檢測試劑盒(GK500705,Gene Tech, 盒中包括通用型二抗,DAB及稀釋液)。

    .2   胚胎來源   收集蘇州大學附屬第二 醫院 婦產科,蘇州市婦幼保健中心人工中止妊娠的5~0周人胚,每例胚胎均經孕婦和道義委員會同意,胚胎需完整,無嚴重污染。

    .3   人EG細胞的原代培養   取5~0周流產胚胎,在流產后6 h內,于超凈工作臺內,用含雙抗(400 U/ml、400 U/ml)的無Ca2+、Mg2+的PBS沖洗胚胎,將胚胎移入無菌培養皿,打開胚體體腔,去除內臟,將背側腸系膜及兩邊的生殖嵴從胚體背側撕下,用含高濃度雙抗的無菌PBS沖洗組織塊數次,將取出的組織切成 mm3左右的小塊。將切碎的組織塊移入4個培養瓶內,兩瓶滴加少量培養液A, 兩瓶滴加少量培養液B。于37 ℃、5%CO2條件下培養,24 h后加入足量培養液。以后每2天半量換液,每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態。

    .4   人EG細胞的傳代培養   挑選細胞已鋪滿瓶底的培養瓶,棄去瓶內培養液,用0.25%-0.02%EDTA溶液~2 ml消化細胞,2~4 min后,鏡下觀察,當人EG細胞集落開始分散形成由數個細胞組成的細胞團時,加入3 ml與原培養液相同的A或B培養液終止消化。用吹管將細胞吹打成單細胞懸液,吸出一半移入另一個培養瓶,于37 ℃、5% CO2條件下培養,次日換液。追蹤觀察傳代細胞的生長狀況。

    .5   移植細胞的制備   移植前 h,以無菌接種針挑取傳代培養至第4代人EG細胞集落,0.25%-0.02%EDTA消化[3],待細胞發生胞質回縮,細胞集落分散開時,即加含血清培養基終止消化,用吸管反復輕輕吹打瓶底,使細胞成為均勻的單細胞懸液,用無菌PBS離心洗滌2次,將細胞吹打均勻,計數板計數,調密度至×06/ml。以微量注射器吸取50 μl,置4 ℃待用。

    .6   實驗動物分組及心肌梗死模型制作   將體重200~250 g SD大鼠40只隨機分為2組:()急性心肌梗死+人EG細胞(AMI+hEGcs, n=28);大鼠心肌梗死后在梗死區邊緣分四點注射各點注入2 μl細胞懸液;(2)急性心肌梗死對照組(AMI+PBS,n=2):大鼠心肌梗死后在梗死區邊緣分4點注射各點注入2 μl PBS。具體步驟參照 文獻 [4]。建模成功后即在心肌梗死區邊緣用微量注射器分4點注射,各點注入2 μl人EG細胞懸液,密度為×06/ml,對照組以同樣方法注入等量的無菌PBS。關胸,維持輔助呼吸至自主呼吸恢復,送回籠中飼養。術后肌肉注射青霉索40 U以預防感染,并在30 ℃條件下蘇醒。全手術過程為無菌操作,術后不需拆線。

    .7   免疫組織化學法鑒定   移植后 d、、2、4周,分別取7只移植組和3只對照組大鼠,用4%腹腔注射麻醉,取出心,PBS沖洗血液,去除左右心房和右心室,將左心室部位用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,連續切片,石蠟切片采用二步法進行免疫組織化學標記,一抗分別為鼠抗人細胞核單抗(∶00,MAB28),二抗為通用型二抗,顯微鏡下觀察。實驗嚴格按照說明書進行操作。

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